生物化学实验手册

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实验六 DNA的提取和分析（一） ​

细菌总 DNA 的提取 ​

目的和要求 ​

了解和掌握CTAB法提取细菌总DNA的原理和方法。

实验原理 ​

DNA在生物体内是与蛋白质形成复合物的形式存在的，因此提取出脱氧核糖核蛋白复合物后，必须将其中蛋白质去除。CTAB（溴代十六烷基三甲胺）是一种去污剂，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中可溶并且稳定存在，若降低盐浓度，CTAB与核酸的复合物会沉淀出来，而大部分蛋白和多糖仍溶于溶液中。

CTAB/NaCl法提取的DNA纯度较高，蛋白杂质较少，保存时间长。

实验试剂和器材 ​

（一）试剂 ​

1.大肠杆菌菌株 2.LB培养基：胰蛋白胨 ，酵母粉 ，NaCl ，加蒸馏水至1升，灭菌。 3. TE缓冲液：10mMTris-HCl，0.1mMEDTA（pH8.0) 4. SDS 5. 蛋白酶K（20mg/mL） 6.5 M NaCl 7. CTAB/NaCl溶液 ： CTAB溶于 NaCl溶液中，加热到 使之溶解，然后室温保存。 8. 酚/氯仿/异戊醇（25:24:1） 9. 异丙醇 10.70%乙醇 11.RNaseA:

（二）器材 ​

锥形瓶（ ），洁净工作台，摇床， 离心管，恒温水浴，离心机，移液枪。

实验方法 ​

  1. 将菌株接种于液体LB培养基， 震荡培养过夜。

  2. 取 培养物 离心 。

  3. 沉淀物加入 的 TE 缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入 SDS 和 的蛋白酶 K，轻柔混匀，于 温育 1 小时。

  4. 加入 , 充分混匀, 再加入 溶液, 混匀后 温育 。

  5. 加入等体积（约 ）的酚/氯仿/异戊醇充分混匀， 离心 ，将上清转入一只新管中，加入 0.7 倍体积的异丙醇（用前预冷），轻轻混合直到 DNA 沉淀下来， 离心 ，留取沉淀，弃上清。

  6. 沉淀用 的 乙醇洗涤, 离心 , 弃上清。再离心 , 将上清吸取干净。在洁净工作台中干燥, 重溶于 缓冲液(含 RNaseA, 终浓度 ) 中, 保温 分钟。 贮存。以上 DNA 样品将用于实验七和实验八。

注意事项 ​

CTAB 有毒，是一种兴奋剂，可因吸入、咽下或皮肤吸收而受到危害。操作时戴合适的手套。

思考题 ​

为保证DNA的完整性，在提取过程中应注意什么？

危害与防护 ​

实验室安全风险评估与防护指南 ​

免责声明: 本指南由AI生成，仅供参考。所有实验操作必须在合格人员的监督下，并严格遵守您所在机构的具体安全规章制度（SOP）。在开始实验前，请务必查阅并理解所有化学品的安全技术说明书（SDS）。

1. 化学品危害分析

  • CTAB (溴代十六烷基三甲胺):

    • GHS危险性: 腐蚀性、刺激物、健康危害、环境危害。
    • 主要暴露途径: 吸入、皮肤接触、食入。
    • 靶器官: 中枢神经系统、肝脏（职业性肝毒素）、皮肤（致敏剂）。
    • 急性接触症状: 皮肤刺激、灼伤，可能影响神经系统和肝脏功能。
    • 物理危害: 无特定物理危害警告。

  • 氯仿:

    • GHS危险性: H301 (吞食有毒), H331 (吸入有毒), H351 (怀疑致癌)。
    • 主要暴露途径: 吸入、皮肤吸收、食入、皮肤/眼睛接触。
    • 靶器官: 肝脏、肾脏、中枢神经系统、眼睛、皮肤。
    • 急性接触症状: 咳嗽、呼吸困难、头晕、嗜睡、头痛、恶心、意识丧失。
    • 物理危害: 易挥发，火灾风险。

3. 关键操作风险预警 (按实验步骤)

  • 步骤: 配置CTAB/NaCl溶液 (65℃加热)

    • 风险剖析: CTAB在水中加热溶解。加热过程可能产生蒸汽，增加吸入风险，同时存在热液体飞溅的可能。
    • 核心风险: 吸入性中毒与热灼伤

  • 步骤: 加入酚/氯仿/异戊醇混合物

    • 风险剖析: 氯仿具有致癌性和中枢神经系统抑制作用。在通风橱外操作会导致有害蒸汽直接吸入。
    • 核心风险: 慢性毒性累积与神经系统损伤

  • 步骤: 异丙醇沉淀DNA (使用预冷试剂)

    • 风险剖析: 使用挥发性溶剂，可能产生易燃蒸汽和吸入毒性。
    • 核心风险: 火灾风险与毒性暴露

4. 综合安全防护措施

  • 个人防护装备 (PPE):

    • 通用要求: 始终穿着实验服和封闭式实验鞋。
    • 手套: 双层丁腈手套（内层薄，外层厚）。
    • 眼部防护: 化学安全护目镜，在涉及液体转移时考虑使用全面型防护面罩。
    • 呼吸防护: 在通风橱外操作时，强烈建议佩戴活性炭过滤呼吸器。
    • 其他: 在配置高浓度CTAB或氯仿操作时佩戴防化围裙。

  • 工程控制:

    • 强制要求: 所有涉及CTAB和氯仿的操作必须在化学通风橱中进行。
    • 环境控制: 保持实验室良好通风，远离火源。

5. 应急处理预案

  • 化学品接触:
    • 皮肤接触: 立即用大量流水冲洗至少15分钟，脱去污染衣物，就医。
    • 眼睛接触: 立即用洗眼器连续冲洗至少15分钟，立即就医。
    • 吸入: 移至空气新鲜处，如出现呼吸困难立即就医。
  • 小型泄漏: 使用合适的吸收材料（如沙土）覆盖收集，按危险废弃物处理。
  • 火灾: 立即关闭电源，使用二氧化碳或干粉灭火器，保持距离。

6. 特别注意事项

  • CTAB为有毒兴奋剂，操作时应佩戴合适的手套，避免吸入、咽下或皮肤吸收。

7. DNA完整性保护要点

  • 轻柔操作，避免剧烈震荡
  • 严格控制温度条件
  • 及时处理新鲜样本
  • 所有废液按正确分类处理

以上风险评估基于权威的PubChem数据库查询结果。由于氯仿被IARC列为2B类致癌物（可能对人类致癌），实验过程中务必严格遵守所有安全操作规程，确保人员和环境安全。