生物化学实验手册

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实验九 DNA 的提取和分析（四） ​

DNA的琼脂糖凝胶电泳 ​

目的和要求 ​

掌握DNA的琼脂糖凝胶电泳法。

实验原理 ​

DNA分子在碱性环境中 带负电荷，在电场中向正极移动。不同的DNA分子由于其电荷、分子量以及构象不同，电泳时有不同的迁移率，所以可通过凝胶电泳使其分离。在紫外灯下，凝胶中的DNA可与溴化乙锭(EB)结合，显示为红色荧光条带。

琼脂糖凝胶电泳所需DNA样品量仅为 。溴化乙锭检测DNA灵敏度很高， 核酸样品即可检出。

DNA在凝胶中的迁移率与分子大小的对数成反比。将未知DNA样品与DNAMarker相比较，可知DNA片段的大小。质粒DNA具有共价闭环DNA（cccDNA）、线形DNA和开环的双连环状DNA（opDNA）3种形式。在电场中，超螺旋DNA比线形和开环DNA泳动快。在制备的质粒中，通常存在超螺旋和开环DNA，因此可显示出2条电泳条带。

实验试剂和器材 ​

（一）试剂： ​

1.DNA样品：细菌染色体DNA、PCR产物等。

  1. 标准DNAMarker

  2. TAE缓冲液 (pH8.0):每升溶液中含有 Tris, 冰乙酸， EDTA。电泳时稀释成 浓度使用。

4.6×loadingbuffer（溴酚兰-甘油指示剂）：含 溴酚蓝， 甘油。

  1. 溴化乙啶染液: 称取 溴化乙啶, 用重蒸水溶解定容到 , 取 此溶液用 TAE缓冲液稀释到 , 最终浓度为 。

（二）器材 ​

离心管，电泳槽，电泳仪，移液枪，紫外成像仪。

实验方法 ​

  1. 制胶：称取琼脂糖粉末，置于三角瓶中，加入 TAE 缓冲液配成 或 的浓度，加热使琼脂糖全部融化于缓冲液中，待溶液温度降至 时，立即倒入制胶槽中，插入样品梳。在室温放置 h，待凝胶全部凝结后，轻轻拔出样品梳。然后在电泳槽中加入电泳缓冲液直到没过凝胶为止。

  2. 加样：取适量 DNA 样品，按比例加入 loading buffer，混匀后小心地加到样品槽中。同时，在另一个样品槽中加入适量 DNA 标准物（DNA Marker），在同一块凝胶板上进行电泳。

  3. 电泳：维持恒压 ，电泳 ，直到溴酚兰指示剂移动到凝胶底部，停止电泳。

  4. 染色：将凝胶取出后浸入 溴化乙啶溶液中，染色 。染液可反复多次使用。

  5. 观察：将凝胶板置于 波长紫外灯下进行观察。DNA存在的位置呈现橙黄色荧光。

注意事项 ​

  1. 溴乙啶有毒，配制和使用溶液时要戴手套，勿将溶液滴洒在台面或地面上。溴乙啶溶液于室温保存在棕色瓶中。

  2. 倒凝胶板时不要太厚，否则影响电泳效果。

思考题 ​

  1. 根据本实验结果,能否确定细菌 DNA 的分子量,为什么？
  2. 溴化乙啶有毒，它的作用机理是什么？

危害与防护 ​

实验室安全风险评估与防护指南 ​

免责声明: 本指南由AI生成，仅供参考。所有实验操作必须在合格人员的监督下，并严格遵守您所在机构的具体安全规章制度（SOP）。在开始实验前，请务必查阅并理解所有化学品的安全技术说明书（SDS）。

1. 化学品危害分析

  • 溴化乙锭 (Ethidium Bromide):
    • GHS危险性: GHS06 (急性毒性), GHS08 (健康危害)
    • 主要暴露途径: [吸入]、[皮肤接触]、[食入]
    • 靶器官: 中枢神经系统、周围神经系统
    • 急性接触症状: 咳嗽、咽喉疼痛、眼部红肿、震颤、虚脱和镇静
    • 毒性数据:
      • 小鼠腹腔注射LD50: 20 mg/kg
      • 小鼠皮下注射LD50: 110 mg/kg
      • 大鼠静脉注射LD50: 27 mg/kg
      • 作用机理: 溴化乙锭是DNA嵌入剂，能插入DNA双螺旋结构，导致DNA结构改变和突变

2. 关键操作风险预警 (按实验步骤)

  • 步骤: 配制0.5μg/mL溴化乙锭染液

    • 风险剖析: 称量5mg溴化乙锭粉末时，极易产生粉尘和气溶胶，将固体的毒性和诱变性风险转化为吸入中毒风险
    • 核心风险: 吸入中毒 与 诱变暴露风险

  • 步骤: 染色操作 - 将凝胶浸入溴化乙锭溶液中

    • 风险剖析: 倾倒和转移溴化乙锭溶液时存在滴溅风险，可能导致化学品与皮肤或眼睛直接接触
    • 核心风险: 化学灼伤 与 直接皮肤接触

3. 综合安全防护措施

  • 个人防护装备 (PPE):

    • 手部防护: 必须佩戴双层丁腈手套
    • 眼部防护: 必须佩戴化学安全护目镜
    • 呼吸防护: 在通风橱内操作，如必须在普通环境下操作，需佩戴N95口罩
    • 身体防护: 标准实验服，如有大量液体操作需求，建议加穿防化围裙

  • 工程控制:

    • 溴化乙锭染液的配制和使用必须在化学通风橱内进行
    • 确保实验室有良好的一般通风

4. 安全操作规程

  • 始终在通风橱内操作溴化乙锭粉末和溶液

  • 缓慢倾倒溴化乙锭溶液，避免溅出

  • 操作时穿戴完整PPE，切勿徒手接触任何可能沾染溴化乙锭的器具

  • 废物处理:

    • 溴化乙锭废液需专门收集，按照有毒化学废物处理

  • 被溴化乙锭污染的枪头、离心管等均作为危险废物处理

5. 应急处理预案

  • 皮肤接触: 立即脱去污染衣物，用大量清水冲洗至少15分钟
  • 眼睛接触: 立即用洗眼器冲洗至少15分钟，寻求医疗救助
  • 小型泄漏: 佩戴适当PPE，用吸附材料(如活性炭、沙子)覆盖吸收
  • 废弃处理: 污染的凝胶、枪头等必须作为危险废物专门处理

安全警示: 溴化乙锭是已知的强诱变剂，必须采取严格防护措施避免任何形式的人体接触。