实验十 酪氨酸酶的动力学分析
目的和要求
- 学会测定酶反应速度的基本方法。
- 掌握测定米氏常数 值的原理和方法。
实验原理
酶反应速度可以用单位时间内、单位体积中底物的减少或产物的增加量来表示。所以反应速度的单位是浓度/单位时间。
酶的底物浓度与反应速度的关系一般符合米氏（Michaelis-Menten）理论。
米氏公式：
酪氨酸酶可催化L-多巴生成的多巴醌，多巴醌在 处有最大吸收峰。反应速度可用单位时间内多巴醌的增加来表示。
本实验以酪氨酸酶（Tyrosinase，EC1.14.18.1）为例，利用双倒数作图法，测定 值。
试剂和器材
（一）试剂
- 磷酸钠缓冲液，0.1 M，pH7.0
- 酞氨酸酶 3.L-多巴，
（二）器材
可见光分光光度计、试管、吸量管、移液枪。
实验方法
（一）酶活性的测定
在比色杯中，按下表依次加入试剂：
| 管号 | 1 | 2 | 3 |
|---|---|---|---|
| L-多巴(mL) | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
| 磷酸缓冲液(mL) | 0.995 | 0.99 | 0.985 |
| 酪氨酸酶(mL) | 0.005 | 0.01 | 0.015 |
以 L-多巴 磷酸缓冲液调零。加入酶液后立即混匀，并每隔15秒读取 处的吸光值。测定2分钟，将各时刻的光吸收值记录在下表中：
| 管号时刻(秒) | 1 | 2 | 3 |
|---|---|---|---|
| 0 | |||
| 15 | |||
| 30 | |||
| 45 | |||
| 60 | |||
| 75 | |||
| 90 | |||
| 105 | |||
| 120 |
绘制A-t反应进程曲线，A值变化在 所对应的酶浓度将被选定用于下一步实验。
（二）米氏常数测定
在另一个比色杯中，根据已确定的酶浓度，例如酶体积为 ，则按下表依次加入试剂，分别记录各管反应开始时 和 t 分钟后的 。每管反应体系仍为 。以 磷酸缓冲液调零。
| 管号 | 15 mL L-多巴(mL) | 磷酸缓冲液(mL) | 酪氨酸酶(mL) |
|---|---|---|---|
| 1 | 0.05 | 1.44 | 0.01 |
| 2 | 0.1 | 1.39 | 0.01 |
| 3 | 0.15 | 1.34 | 0.01 |
| 4 | 0.2 | 1.29 | 0.01 |
| 5 | 0.25 | 1.24 | 0.01 |
| 6 | 0.3 | 1.19 | 0.01 |
分别记录反应开始（ ）和适当时间后的 值（ ），记录于下表中：
| 管号 | L-多巴浓度[S] (mM) | A0 | A1 | ΔA(A1-A0) | V(mM/min) |
|---|---|---|---|---|---|
| 1 | |||||
| 2 | |||||
| 3 | |||||
| 4 | |||||
| 5 | |||||
| 6 |
根据朗伯-比尔定律可计算出产物浓度的变化（ ）：
摩尔消光系数： d：比色杯的厚度（cm）
计算反应初速度（V），并填入表中。绘制 曲线，并绘制 双倒数曲线，分别求出 和 。
注意事项
- 酶制剂要低温存放。
- 量取试剂要准确。
- 在比色杯中混匀要快速，准确计时。
- 选择适宜的酶浓度，在 内 A 值的变化应在 0.2-0.3 之间。
- L-多巴变为棕色不能使用。
思考题
- 为什么要用酶反应初速度计算 值？如何确定酶反应时间？
- 除了双倒数作图法，还有什么方法可以求出 值？
危险与防护
实验室安全风险评估与防护指南
免责声明: 本指南由AI生成，仅供参考。所有实验操作必须在合格人员的监督下，并严格遵守您所在机构的具体安全规章制度（SOP）。在开始实验前，请务必查阅并理解所有化学品的安全技术说明书（SDS）。
1. 化学品危害分析
- L-多巴 (L-DOPA, CID:6047):
- GHS危险性:
- H301: 吞食有毒
- H311: 皮肤接触有毒
- H331: 吸入有毒
- H370: 对器官造成损害（中枢神经系统、心血管系统）
- 主要暴露途径: 吸入、皮肤接触、食入
- 靶器官: 中枢神经系统、心血管系统、肝脏、肾脏
- 急性接触症状: 恶心、呕吐、头晕、头痛、心律失常、低血压、意识模糊、幻觉
- 物理危害: 无易燃/爆炸性，但溶液在空气中易氧化变棕失效
- GHS危险性:
- 酪氨酸酶:
- 未查询到权威数据，作为蛋白质类物质可能引起过敏反应
- 磷酸钠缓冲液 (pH7.0):
- 低风险，高浓度可能引起眼/皮肤刺激
2. 关键操作风险预警
- 步骤: 配制L-多巴溶液
- 风险剖析: 称量/转移L-多巴粉末时可能产生可吸入粉尘，将固体毒性转化为吸入暴露风险
- 核心风险: 吸入中毒
- 步骤: 移液操作
- 风险剖析: 使用移液枪转移L-多巴溶液时存在滴溅风险，可能导致皮肤/眼睛接触刺激性溶液
- 核心风险: 化学灼伤
- 步骤: 比色杯混合
- 风险剖析: 快速混匀操作可能产生气溶胶，增加吸入暴露风险
- 核心风险: 吸入暴露
3. 综合安全防护措施
- 个人防护装备 (PPE):
- 手套: 丁腈双层手套（防L-多巴渗透）
- 眼部防护: 化学护目镜+面部防护罩
- 身体防护: 防化围裙+实验服
- 呼吸防护: 通风橱内操作（必需）
- 工程控制:
- 所有液体转移操作必须在化学通风橱内进行
- 确保实验室整体通风良好
- 安全操作规程:
- 使用密闭容器转移L-多巴溶液
- 移液时保持垂直，避免产生气泡
- 废弃L-多巴溶液需单独收集（含铜副产物）
- 变棕的L-多巴立即停止使用
- 特殊防护:
- 心血管疾病/神经系统疾病人员避免操作
- 孕妇严禁接触L-多巴
4. 应急处理预案
- 皮肤接触: 立即脱除污染衣物，用大量流水冲洗15分钟
- 眼睛接触: 撑开眼睑，洗眼器冲洗15分钟
- 吸入暴露: 转移至空气新鲜处，呼吸困难时给氧
- 泄漏处理:
- 小量：用吸水材料覆盖，收集至密闭容器
- 大量：疏散区域，使用防化沙围堵
- 医疗救助: 携带SDS就医，告知接触物质为L-多巴（CID:6047）
本预案基于最小可行性原则制定，需确保洗眼器（10m内）和急救箱（含丁腈手套、吸附剂）就位。实验全程需两人协同操作。