实验五 蛋白质的提取和分析（三）
蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
目的和要求
- 掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理。
- 掌握垂直板状凝胶电泳槽的使用和凝胶的配制方法。
实验原理
带电颗粒在电场的作用下，向着与其相反的电极移动，称为电泳。
电泳做为一种物质分离及鉴定技术，其原理在于任一物质质点，由于其本身的解离作用或由于表面上吸附有其它带电质点，在电场中便会向一定的电极移动。蛋白质是两性电解质，在一定的 条件下，就会解离而带电，带电的性质和多少取决于蛋白质分子的性质和溶液的 值和离子强度。处于 的蛋白质分子所带的电荷为零，在电场中不移动。若 ，蛋白质分子带正电荷，在电场中向负极移动， 的情况正好相反。
目前所采用的电泳方法大致可分为三类：显微电泳，自由界面电泳及区带电泳。以区带电泳应用比较广泛，区带电泳按其支持物的物理性状，可以分为四大类：（1）滤纸电泳及薄膜电泳（如醋酸纤维素薄膜电泳）；（2）粉末电泳：如纤维素粉、淀粉电泳等；（3）细丝电泳：如尼龙丝、人造丝电泳；（4）凝胶电泳：如聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶电泳。
聚丙烯酰胺凝胶，是由丙烯酰胺单体（Acr）和少量的交联剂N，N'-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂（过硫酸胺或核黄素）和加速剂（N，N，N'N'-四甲基乙二胺）的作用下聚合交联成的三维网状结构的凝胶。以此凝胶为支持物的电泳称聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。具有机
械性能好、化学性能稳定、灵敏度好、分辨率高的优点。PAGE应用十分广泛，可用于蛋白质、酶、核酸等生物分子的分离、定性、定量和少量制备等。
SDS（十二烷基硫酸钠）是一种阴离子去污剂，它能破坏蛋白质分子中的疏水相互作用，而巯基乙醇能打开二硫键。因此，在SDS和巯基乙醇存在下，蛋白质的多肽链处于伸展状态。SDS与蛋白质分子结合，形成SDS一蛋白质复合物。由于SDS是阴离子，使蛋白质分子表面被覆盖上相同密度的负电荷，掩盖了原有蛋白质电荷的差异。SDS一蛋白质复合物呈长椭圆棒状，短轴长度相等，约为 ，而长轴与蛋白质的分子量成正比。因此，蛋白质的电泳迁移率主要取决于蛋白质分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。采用SDS-PAGE，可对蛋白质分子量和纯度进行鉴定，是一种经济、快速、重复性好的方法。
SDS-PAGE 根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类。前者电泳体系中缓冲液 及凝胶浓度相同；后者电泳体系中缓冲液离子成分、 、凝胶浓度等是不连续的。
（1）不连续系统对样品的浓缩效应
凝胶层的不连续性：不连续系统的凝胶包括浓缩胶和分离胶。浓缩胶的孔径大，分离胶的孔径小。在电场的作用下，蛋白质颗粒在大孔胶中泳动时遇到的阻力小，移动快。而在小孔胶中泳动时遇到的阻力大，移动慢。因此，在两层凝胶的交界处，由于凝胶孔径的不连续性使样品迁移受阻而压缩成很窄的区带。
缓冲液离子成分和 的不连续性: 在两层凝胶中均有 Tris 和 。Tris 的作用是维持溶液的电中性及 。 在一定 条件下易解离出 , 它在电场中迁移率大, 走在最前面, 故称为快离子或前导离子。电极缓冲液中的甘氨酸在 的缓冲液中解离度很小, 仅为 , 因而在电场中迁移率很小, 称为慢离子或尾随离子。SDS-蛋白质复合物带负电荷, 在电场中可移向正极, 其有效迁移率介于快慢离子之间, 于是蛋白质就在快慢离子间形成的界面处, 被浓缩成极窄的区带。当进入 的分离胶时, 甘氨酸解离度增加, 其有效迁移率超过 SDS-蛋白质复合物, 因此氯离子和甘氨酸离子沿着离子界面继续前进。蛋白质分子由于分子量大, 被留在后面, 然后分离成多个区带。
（2）凝胶对样品分子的筛选效应（分子筛效应）
电场中，颗粒小、呈球形的样品分子泳动速度快；颗粒大、形状不规则的分子通过凝胶空洞时受到的阻力大，泳动漫。SDS-蛋白质复合物形成近似"雪茄烟"形的长椭圆棒。不同SDS—蛋白质复合物的短轴长度都一样，而长轴长度与蛋白质分子量成正比。因此电泳时，SDS-蛋白质复合物的迁移率主要取决于分子量的大小。
本实验利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法来鉴定溶菌酶的分子量和纯度。
实验试剂和器材
（一）试剂
1.制备分离胶、浓缩胶有关试剂
（1）凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺 ，甲叉双丙烯酰胺 ，加重蒸水溶解后，定容到 。过滤后置棕色瓶中， 保存，一般可放置1个月。 (2) pH8.9 分离胶缓冲液: Tris , 加 , 加重蒸水 使其溶解, 调 , 定容至 保存。 （3） 浓缩胶缓冲液：Tris ，加 ，加重蒸水 使其溶解，调 ，定容至 ， 保存。 （4） 过硫酸铵（用重蒸水新鲜配制）。 （5）TEMED（四乙基乙二胺）原液。
(v/v)甘油。
(w/v) 溴酚蓝：称取 溴酚蓝，加蒸馏水 ，搅拌直到完全溶解，过滤除去聚合的染料。
（w/v）SDS：称取 SDS，加蒸馏水总量至
样品缓冲液（loading buffer）：
| 0.5 mol/L Tris-HCl(pH6.7) | 1.2 mL |
|---|---|
| 50% (v/v) 甘油 | 5 mL |
| 10% SDS | 2 mL |
| β-巯基乙醇 | 0.5 mL |
| 1% 溴酚蓝 | 1 mL |
| ddH₂O | 0.3 mL |
电极缓冲液：称取Tris ，甘氨酸 ，SDS ，加蒸馏水约 ，调 后，用蒸馏水定容至 ， 保存备用。
考马斯亮蓝 R250 染色液：1L
考马斯亮蓝 R250 1.0 g 甲醇 450 mL
蒸馏水 450mL
冰醋酸 100mL
- 考马斯亮蓝脱色液：1L
甲醇 100mL
冰醋酸 100mL
蒸馏水 800 mL
- 低分子量蛋白质 Marker
- 溶菌酶标准样品
- 蛋清溶菌酶样品（制备及纯化方法见实验三）
（二）器材
电泳仪、Bio-Rad Mini-Protean 3 电泳系统，移液枪、烧杯、平皿等。
实验方法
（一）电泳装置的安装
- 带上手套，将玻璃板、样品梳用洗涤剂洗净，用 冲洗数次，再用乙醇擦拭，晾干。
- 将玻璃板的橡胶垫条用吸水纸吸干，然后按Bio-Rad Mini-Protean 3电泳系统的使用说明书安装好玻璃板，固定于制胶板上。
(二)制胶
- 在小烧杯里按下表配好 分离胶 （充分混匀，但不能带入太多的空气）
| 试剂\凝胶浓度 | 8% | 10% | 12% | 15% |
|---|---|---|---|---|
| ddH₂O (mL) | 5.85 | 5.25 | 4.55 | 3.55 |
| 30% 丙烯酰胺(mL) | 2.7 | 3.3 | 4.0 | 5.0 |
| pH8.9分离胶缓冲液(mL) | 1.25 | 1.25 | 1.25 | 1.25 |
| 10% SDS (mL) | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 |
| 10% 过硫酸铵(mL) | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 |
| TEMED (mL) | 0.005 | 0.005 | 0.005 | 0.005 |
注：根据蛋白质样品的分子量大小选择合适的分离胶浓度，确定分离胶所需凝胶溶液体积（Bio-Rad Mini-Protean 3 电泳系统 ，两块分离胶需 ）。
一旦加入 TEMED，聚合马上开始，故需迅速将配好的分离胶混匀，并用移液枪沿着高玻璃一边缓缓将分离胶注入玻璃板之间，灌注时不能有气泡，需留出浓缩胶所需空间（梳子齿长再加1cm）。倒好后，用移液枪吸取 ，贴着玻璃慢慢地在胶面上封上一层水，使凝胶表面变得平整。放置30~40min后，凝胶聚合，在分离胶和水层之间会出现一个清晰的界面。小心倾斜模具，使水流出，用滤纸吸干剩余的水分，注意不要接触胶面。
- 在小烧杯里按下表配好 浓缩胶 （充分混匀）
| ddH₂O | 3.475 mL |
|---|---|
| 30% 凝胶贮液 | 0.8 mL |
| pH6.7 浓缩胶缓冲液 | 0.625 mL |
| 10% AP | 0.05 mL |
| 10% SDS | 0.05 mL |
| TEMED | 0.005 mL |
将小烧杯中的浓缩胶沿着高玻璃一边缓缓地倒入已凝聚好的分离胶上，直到离玻璃板顶端 时，插入梳子。约15~20分钟，浓缩凝胶聚合完成。（注：Bio-Rad Mini-Protean3电泳系统 ，两块浓缩胶需 浓缩胶）
（三）点样
取 蛋白质样品加入Ep管，并加入 loading buffer， 沸水浴煮 冷却后加样。
将适量电极缓冲液加到电泳槽中，电极缓冲液应盖住短玻璃。轻轻拔出样品梳，用移液枪取 样品加到样品槽中，接通电源，稳压 ，等到溴酚蓝刚刚跑出分离胶时，切断电源，停止电泳。
（四）剥胶、染色、脱色
取出夹胶的玻璃板，轻轻地将玻璃板与胶分离。用刀切下浓缩胶，将分离胶放入盛有染色液的大平皿中，半小时后，将染色液倒入回收瓶中，将胶用水洗几次，加入脱色液，放到脱色摇床上进行脱色，过一段时间后看结果。
（五）结果判断
脱色后的凝胶上一般可清楚呈现蛋白质区带，根据蛋白质 Marker 和标准溶菌酶的位置，判断蛋清溶菌酶的分子大小和纯度。
（六）制备凝胶干板
常用凝胶真空器制备干板。若无此仪器，可将脱色后的胶板浸泡在保存液中 小时。然后，在大培养皿内平放一块干净玻璃板（ ），倒少许保存液，在玻璃板上均匀涂开，取一张预先在蒸馏水中浸透的玻璃纸，平铺在玻璃板上，赶走气泡，小心取出凝胶平铺在玻璃纸上，赶走气泡。再取一张浸泡过的玻璃纸覆盖在凝胶上，赶走气泡，将四边多余的玻璃纸紧紧贴于玻璃板的背面。平放于桌上自然干燥 天，即可得到平整、透明的干胶板，可长期保存不褪色，便于定向扫描。
注意事项
制备凝胶应选用高纯度试剂，否则会影响凝胶聚合与电泳效果。
若橡胶垫条、玻璃板不洁净，在电泳时会造成凝胶板与玻璃板或硅橡胶条剥离，产生气泡或滑胶；剥胶时凝胶板易断裂。为防止此现象，所用器材均应严格地清洗。硅橡胶条、梳子可用"洗涤灵"清洗。玻璃板需用重铬酸钾洗液浸泡 小时，或 KOH 的酒精溶液中20分钟以上，用清水冲洗，再用"洗涤灵"刷洗，最后用蒸馏水冲洗，用乙醇冲洗后阴干。
电泳装置安装时，各部件位置要适当，以免缓冲液渗漏。
凝胶完全聚合后，轻轻取出梳子，切勿破坏加样槽底部的平整，以免电泳后区带扭曲。
思考题
- PAGE 方法中如何调节凝胶的孔径？
- 电极缓冲液用过后是否还能利用？为什么？
- 做好SDS-PAGE的关键步骤有哪些？为什么？
危险与防护
实验室安全风险评估与防护指南
实验室安全风险评估与防护指南
免责声明: 本指南由AI生成，仅供参考。所有实验操作必须在合格人员的监督下，并严格遵守您所在机构的具体安全规章制度（SOP）。在开始实验前，请务必查阅并理解所有化学品的安全技术说明书（SDS）。
1. 化学品危害分析
[丙烯酰胺 (Acrylamide)]:
- GHS危险性: H301 (吞食有毒), H311 (皮肤接触有毒), H331 (吸入有毒), H350 (可能致癌), H340 (可能引起遗传缺陷), H372 (长期或反复接触会对器官造成损害)。
- 主要暴露途径: 吸入、皮肤接触、食入。
- 靶器官: 神经系统、生殖系统、肝脏、肾脏。
- 急性接触症状: 皮肤刺激、头晕、乏力、共济失调、四肢麻木。
- 物理危害: 无显著物理危害（非易燃易爆）。
- 致癌性: IARC 2A类（可能人类致癌物），NTP确认致癌物。
- 神经毒性: 导致中枢-周围远端轴突病变，运动功能障碍。
- 其他风险: 生殖毒性（睾丸损伤）、遗传毒性（染色体畸变）。
[N,N'-甲叉双丙烯酰胺 (Bis)]:
- 类似丙烯酰胺，具有神经毒性和生殖毒性（需查阅具体SDS确认）。
[β-巯基乙醇]:
- GHS危险性: H330 (吸入致命), H310 (皮肤接触致命), H300 (吞食致命)。
- 主要暴露途径: 吸入、皮肤接触。
- 急性症状: 强烈气味，吸入可致肺水肿，皮肤接触致灼伤。
[甲醇 (染色液)]:
- GHS危险性: H225 (高度易燃), H301 (吞食有毒), H311 (皮肤接触有毒), H331 (吸入有毒), H370 (损害视觉系统)。
- 靶器官: 视神经、中枢神经系统、肝脏。
[冰醋酸 (脱色液)]:
- GHS危险性: H314 (造成严重皮肤灼伤和眼损伤)。
- 暴露风险: 蒸汽刺激呼吸道，液体接触致化学灼伤。
3. 关键操作风险预警 (按实验步骤)
步骤: 称量/配制丙烯酰胺凝胶
- 风险剖析: 粉末扬尘导致吸入暴露，未戴手套操作导致皮肤接触。神经毒素通过呼吸道/皮肤吸收，攻击运动神经元。
- 核心风险: 神经毒素暴露
步骤: 加入TEMED催化剂
- 风险剖析: 挥发性胺类物质蒸汽吸入刺激呼吸道，接触皮肤可能引发过敏反应。
- 核心风险: 呼吸道刺激与皮肤致敏
步骤: 沸水浴处理含β-巯基乙醇样品
- 风险剖析: 加热使剧毒β-巯基乙醇挥发性增强，通风不足时导致吸入中毒。试管破裂可能造成皮肤接触。
- 核心风险: 剧毒蒸汽吸入
步骤: 电泳槽操作（150V电压）
- 风险剖析: 缓冲液泄漏导致电击风险，SDS接触皮肤引起刺激反应。
- 核心风险: 电击与皮肤刺激
步骤: 染色/脱色（甲醇-冰醋酸体系）
- 风险剖析: 甲醇挥发产生易燃蒸汽+神经毒性蒸汽，冰醋酸倾倒时飞溅风险导致化学灼伤。
- 核心风险: 易燃毒气+化学灼伤
步骤: 剥离凝胶（锐器操作）
- 风险剖析: 刀片使用不当导致割伤，未完全聚合凝胶中的残留单体通过伤口加速吸收。
- 核心风险: 物理创伤+毒素暴露
4. 综合安全防护措施
个人防护装备 (PPE):
- 手部防护: 丁腈手套（内层）+ 防化手套（外层），操作β-巯基乙醇/丙烯酰胺时双层佩戴。
- 眼部/面部: 全面型防护面罩（防飞溅）+ 防雾护目镜（防蒸汽）。
- 身体防护: 防渗透实验服 + 前襟防化围裙。
- 呼吸防护: 通风橱内操作（最低要求）；高暴露步骤（称量粉末/沸水浴）使用N95口罩+有机蒸汽滤盒的半面罩。
工程控制:
- 强制要求: 所有粉末操作（丙烯酰胺/Bis）在通风橱内进行。
- 强烈建议: 沸水浴、染色/脱色步骤在通风橱操作。
- 电泳区域: 保持地面干燥，配备绝缘橡胶垫。
安全操作规程:
- 丙烯酰胺称量使用防静电称量舟，湿巾清洁台面。
- 沸水浴样品管加盖防爆膜，使用试管架夹取。
- 染色液添加采用"高进低出"原则（沿容器壁缓慢倾倒）。
- 凝胶剥离使用塑料刮刀替代刀片。
- 废液分类：含丙烯酰胺废液单独收集，贴神经毒素标签。
应急预案:
- 皮肤接触: 立即用肥皂水冲洗15分钟（丙烯酰胺）/5%碳酸氢钠冲洗（酸碱）。
- 眼睛接触: 洗眼器冲洗20分钟，冰醋酸接触需用生理盐水冲洗。
- 吸入暴露: 转移至空气清新处，β-巯基乙醇吸入立即就医。
- 泄漏处理: 小范围用吸附棉覆盖；大范围撤离并报告。
- 火灾: 甲醇火灾使用二氧化碳灭火器，禁用含水灭火剂。
5. 最小可行性防护方案
- 通风橱内完成所有固体试剂称量
- 丁腈手套+护目镜+实验服全程穿戴
- 沸水浴/染色操作在通风区域进行
- 备好洗眼器接入点和应急喷淋装置
- 高毒区域（β-巯基乙醇操作）实施双人操作制
关键警示：丙烯酰胺暴露症状可能延迟24-48小时出现（乏力、手套袜套样感觉减退），操作后异常体征需立即报告！