实验三 蛋白质的提取和分析（一）
溶菌酶的分离提纯及鉴定
目的和要求
- 了解并掌握从鸡蛋清中粗制备溶菌酶的原理及方法。
- 了解并掌握离子交换层析法分离提纯蛋白质的一般原理和操作方法。
实验原理
溶菌酶广泛存在于动植物和微生物体内。鸡蛋和哺乳动物的泪液、乳汁等是溶菌酶的主要来源。其中鸡蛋中溶菌酶含量可达 。
溶菌酶(lysozyme)又称胞壁质酶(muramidase), 或 N-乙酰胞壁质聚糖水解酶, 是一种有效的抗菌剂。它可以切断某些细菌细胞壁多糖中 N-乙酰氨基葡糖乳酸 (NAM) 和 N-乙酰氨基葡萄糖 (NAG) 之间的 -1,4 糖苷键, 从而溶解这些细菌的细胞壁。溶菌酶相对分子量为 , 由 129 个氨基酸残基组成, 其中含较多的碱性氨基酸, 等电点在 11.0 附近, 最适 , 最适温度为 。
溶菌酶的化学性质非常稳定。在中性条件下，溶菌酶能与鸡蛋清中其他蛋白质形成络合物，抑制了溶菌酶的析出。但如果在该体系中加入酸，降低体系的 值，由于溶菌酶在酸性条件下带正电荷，因此可与酸根负离子生成相应的盐，这样溶菌酶就可以很好地被水抽提。同时，用 滤膜过滤溶液，去除溶液中的杂质，得到溶菌酶的粗提液。
溶菌酶粗制品进一步通过离子交换层析法进行纯化和浓缩。离子交换层析（IEC）是基于待分离物质的酸碱性、极性等差异，它们与离子交换剂的亲和力不同，通过离子之间的吸附和脱吸附而将各组分依次从层析柱中洗脱下来，从而达到分离目的。本实验采用的离子交换层析介质是CM Sepharose FF（快速羧甲基琼脂糖凝胶），它是一种弱酸性阳离子交换剂，当羧甲基解离后，凝胶本身带负电荷。粗提液中的溶菌酶带正电荷，依靠静电吸引，它可结合到琼脂糖凝胶上。然后采用适宜浓度的NaCl溶液，可将溶菌酶从层析柱上洗脱下来。CM Sepharose FF具有物理化学性质稳定、交换容量大、流速快等优点，已广泛用于实验室或大规模生产中蛋白质的制备和纯化。
纯化后的溶菌酶可采用Folin-酚法（Lowry法）或考马斯亮蓝法测定含量（实验四），并采用SDS-PAGE鉴定其纯度和分子量（实验五）。
实验试剂和器材
（一）试剂
新鲜的鸡蛋清、ddH O、盐酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、考马斯亮蓝G-250、NaCl、CM Sepharose FF (Pharmacia)。
（二）器材
过滤器、注射器、台式离心机、恒温水浴锅、移液枪、 聚丙烯层析柱（Qiagen）、Eppendorf离心管等。
实验方法
（一） 蛋清中溶菌酶的提取和纯化
- 取蛋清，加入 1.5 倍体积的 Buffer I（ 含 的 磷酸缓冲液）稀释，搅拌均匀后纱布过滤，滤液调 值至 4.5，静置 ， 离心 。
- 上清液用 过滤器过滤，收集滤液，由此得到溶菌酶粗提液。
- 装柱：取聚丙烯层析柱（1mL），关闭层析柱出口。自顶部徐徐加入2mL CM Sepharose FF悬浮液，待凝胶颗粒沉降后，放出过量的溶液。关闭柱子出口，保持液面高出凝胶表面1cm。
- 平衡：用BufferI（10倍柱床体积）平衡柱床。
- 加样：将 蛋白粗提液沿管壁缓缓加入CM Sepharose FF层析柱中，注意不要冲乱凝胶表层。
- 洗脱：用Buffer I冲洗层析柱（约10倍柱床体积），以除去杂蛋白。在白凹瓷板上，用考马斯亮蓝G-250检测杂蛋白的洗脱情况，至颜色不再变蓝。之后，用Buffer II（pH4.5含 的 磷酸缓冲液）洗脱溶菌酶，用Eppendorf离心管收集溶菌酶洗脱液，每管1ml，共收集 。用考马斯亮蓝G-250检查洗脱情况。
将收集得到的溶菌酶样品放 冰箱保存备用。
（二）溶菌酶浓度的测定
采用 lowry 法或考马斯亮蓝染色法测定蛋白浓度（原理及操作方法参见实验四）。
（三）溶菌酶纯度测定
取适量溶菌酶样品，采用SDS-PAGE电泳法进行样品纯度和分子量鉴定，以标准品为对照（原理及操作方法参见实验五）。
注意事项
要选取新鲜的鸡蛋作为原料，最好为40天内的新鲜鸡蛋，蛋清pH不应低于8.0。新鲜鸡蛋壳和鸭蛋壳也可以作为原料，但收率要比蛋清低。
要防止蛋清被细菌污染变质，不要混入蛋黄和其它杂质，以免影响凝胶对蛋白质的吸附力。
始终保持住内页面高于凝胶表面，否则会导致凝胶变干或混入气泡，影响分离效果。
层析时，应考虑层析介质对样品量的承载量。样品量过大，会导致吸附不完全，并直接影响到分离效果。
思考题
- 离子交换层析法分离纯化蛋白质具有哪些局限性？
- 概述蛋白质分离提纯的基本原理和一般流程。
危害与防护
实验室安全风险评估与防护指南
免责声明: 本指南由AI生成，仅供参考。所有实验操作必须在合格人员的监督下，并严格遵守您所在机构的具体安全规章制度（SOP）。在开始实验前，请务必查阅并理解所有化学品的安全技术说明书（SDS）。
1. 化学品危害分析
- 盐酸 (Hydrochloric Acid) - CID: 313:
- GHS危险性: GHS05 (腐蚀性), GHS07 (有害)
- 信号词: Danger
- 危害声明: H290 (可能腐蚀金属), H314 (造成严重皮肤灼伤和眼损伤), H335 (可能引起呼吸道刺激)
- 主要暴露途径: 吸入、皮肤接触、眼睛接触
- 靶器官: 呼吸道、皮肤、眼睛
- 急性接触症状: 皮肤和眼睛灼伤、呼吸道刺激、咳嗽、呼吸急促
- 物理危害: 腐蚀性
- 磷酸二氢钠 (Sodium Dihydrogen Phosphate) - CID: 516951:
- GHS危险性: GHS07 (刺激物)
- 信号词: Warning
- 危害声明: H315 (造成皮肤刺激), H319 (造成严重眼刺激), H335 (可能引起呼吸道刺激)
- 主要暴露途径: 吸入、皮肤接触、眼睛接触、食入
- 靶器官: 眼睛、皮肤、呼吸道
- 急性接触症状: 眼睛和皮肤刺激、呼吸道不适
- 磷酸氢二钠 (Disodium Hydrogen Phosphate) - CID: 24203:
- GHS危险性: GHS07 (刺激物)
- 信号词: Warning
- 危害声明: H315 (造成皮肤刺激), H319 (造成严重眼刺激)
- 主要暴露途径: 吸入、皮肤接触、眼睛接触
- 靶器官: 眼睛、皮肤
- 氯化钠 (Sodium Chloride) - CID: 5234:
- GHS危险性: GHS07 (刺激物)
- 信号词: Warning
- 危害声明: H315 (造成皮肤刺激), H319 (造成严重眼刺激)
- 主要暴露途径: 眼睛接触、皮肤接触
- 考马斯亮蓝G-250 (Coomassie Brilliant Blue G-250) - CID: 14773:
- GHS危险性: GHS07 (刺激物)
- 信号词: Warning
- 危害声明: H315 (造成皮肤刺激), H319 (造成严重眼刺激), H335 (可能引起呼吸道刺激)
- 主要暴露途径: 吸入、皮肤接触、眼睛接触
- 靶器官: 眼睛、皮肤、呼吸道
3. 关键操作风险预警 (按实验步骤)
步骤: 调节蛋清溶液pH值至4.5（涉及盐酸）
- 风险剖析: 盐酸具有强腐蚀性和挥发性。在用移液枪转移和滴加盐酸的过程中，挥发出的氯化氢气体可能被吸入，对呼吸道造成强烈刺激；同时，任何滴溅都可能导致严重的皮肤化学灼伤或眼睛损伤。
- 核心风险: 吸入腐蚀性气体与化学灼伤
步骤: 使用0.45μm过滤器过滤（涉及蛋白粗提液）
- 风险剖析: 过滤过程中产生的液滴可能形成气溶胶，若溶液中含有微生物污染物，可能造成生物污染扩散。
- 核心风险: 气溶胶扩散风险
步骤: 装柱和加样操作（涉及CM Sepharose FF和蛋白粗提液）
- 风险剖析: 在层析柱操作中，倾倒和转移悬浮液时存在液体溅洒的可能性，可能导致实验台面污染和人员接触风险。
- 核心风险: 液体溅洒污染
步骤: 洗脱过程（涉及高浓度NaCl缓冲液）
- 风险剖析: 使用500mM NaCl溶液进行洗脱时，可能存在溶液飞溅风险，特别是当操作不当或容器不当时。
- 核心风险: 溶液飞溅和接触
步骤: SDS-PAGE电泳（后续实验）
- 风险剖析: 涉及有毒化学品如丙烯酰胺、SDS等，需要特别注意皮肤接触和吸入风险。
- 核心风险: 剧毒化学品暴露风险
4. 综合安全防护措施
个人防护装备 (PPE):
- 通用要求: 始终穿着实验服。
- 手部防护: 佩戴丁腈手套（对盐酸和蛋白质具有良好的防护效果）。
- 眼部防护: 化学安全护目镜必须全程佩戴，特别是在处理盐酸时。
- 呼吸防护: 在处理盐酸时应在通风橱内操作；若无通风橱，建议佩戴防酸性气体口罩。
- 身体防护: 除实验服外，在处理大量盐酸时可考虑使用防化围裙。
工程控制:
- 通风设施: 所有涉及盐酸的操作必须在化学通风橱中进行。
- 生物安全: 使用新鲜鸡蛋并防止细菌污染，避免潜在的生物危害。
安全操作规程:
- 在调节pH值时，缓慢滴加盐酸，并持续搅拌。
- 保持工作台面整洁，及时清理溅洒物。
- 正确处理实验废弃物，特别是含酸废液。
5. 应急处理预案
- 化学品接触:
- 皮肤接触: 立即脱去污染的衣物，用大量流动清水冲洗至少15分钟。
- 眼睛接触: 立即用洗眼器冲洗至少15分钟，并寻求医疗救助。
- 吸入: 迅速转移到空气新鲜处，保持呼吸道通畅，必要时吸氧。
- 小型泄漏: 使用合适的吸附材料（如沙子、硅藻土）覆盖吸收，然后收集处理。
- 生物安全: 如接触污染鸡蛋清，立即用肥皂和水彻底清洗。
- 设施确认: 实验开始前确认洗眼器、紧急喷淋装置的位置和可用性。
基于获取到的详细化学品安全数据，我现在为您生成完整的实验室安全风险评估报告：
实验室安全风险评估与防护指南
免责声明: 本指南由AI生成，仅供参考。所有实验操作必须在合格人员的监督下，并严格遵守您所在机构的具体安全规章制度（SOP）。在开始实验前，请务必查阅并理解所有化学品的安全技术说明书（SDS）。
1. 化学品危害分析
盐酸 (Hydrochloric Acid) - CID: 313:
- GHS象形图: 压缩气体、腐蚀性、急性毒性
- 信号词: Danger (危险)
- 主要危害特性: 强腐蚀性和高毒性
- 急性毒性数据:
- 大鼠吸入LC50: 3124 ppm/1小时
- 小鼠吸入LC50: 1108 ppm/1小时
- 主要暴露途径: 吸入、皮肤接触、眼睛接触
- 靶器官: 呼吸系统、皮肤、眼睛
- 急性接触症状: 咳嗽、喉咙痛、呼吸困难、皮肤和眼睛严重灼伤、肺部水肿
- 长期暴露效应: 可能导致肝脏损伤、鼻腔口腔溃疡、牙齿发黄和牙釉质侵蚀
- 物理危害: 强腐蚀性、挥发产生刺激性气体
磷酸氢二钠 (Disodium Hydrogen Phosphate) - CID: 24203:
- GHS象形图: 刺激物
- 信号词: Warning (警告)
- 危害特性: 皮肤和眼睛刺激物
考马斯亮蓝G-250 (Coomassie Brilliant Blue G-250) - CID: 14773:
- GHS象形图: 氧化剂、刺激物
- 物理危害: 氧化性，遇火可能加剧燃烧
3. 关键操作风险预警 (按实验步骤)
步骤: 调节蛋清溶液pH值至4.5（涉及盐酸）
- 风险剖析: 盐酸具有强腐蚀性和挥发性。在用移液枪转移和滴加盐酸的过程中，挥发出的氯化氢气体可能被吸入，对呼吸道造成强烈刺激，可能导致肺部水肿；同时任何滴溅都可能导致严重的皮肤化学灼伤或永久性眼睛损伤。
- 核心风险: 吸入腐蚀性气体与化学灼伤
步骤: 使用0.45μm过滤器过滤（涉及蛋白粗提液）
- 风险剖析: 过滤过程中可能需要使用注射器施加压力，这可能产生气溶胶，增加吸入暴露风险。
步骤: 装柱和加样操作（涉及CM Sepharose FF和蛋白粗提液）
- 风险剖析: 在层析柱操作中，倾倒和转移悬浮液时存在液体溅洒的可能性。
- 核心风险: 液体溅洒污染
步骤: 洗脱过程（涉及500mM NaCl高浓度溶液）
- 风险剖析: 高浓度盐溶液可能对皮肤产生刺激。
- 核心风险: 皮肤刺激风险
4. 综合安全防护措施
个人防护装备 (PPE):
- 通用要求: 始终穿着实验服
- 手部防护: 必须佩戴丁腈手套，提供良好的化学防护
- 眼部防护: 化学安全护目镜必须全程佩戴
- 呼吸防护: 所有涉及盐酸的操作必须在化学通风橱中进行
- 面部防护: 在处理盐酸时建议使用全面型防护面罩
- 特别提醒: 操作盐酸时增加佩戴防化围裙
工程控制:
- 通风设施: 所有盐酸相关操作必须在通风橱内进行
安全操作规程:
- 调节pH值时，缓慢滴加盐酸，并持续搅拌防止局部过酸
- 保持工作台面整洁，及时清理溅洒物
5. 应急处理预案
- 化学品接触:
- 皮肤接触: 立即脱去污染的衣物，用大量流动清水冲洗至少15分钟
- 眼睛接触: 立即用洗眼器冲洗至少15分钟，并寻求医疗救助
- 吸入: 迅速转移到空气新鲜处，保持呼吸道通畅
- 生物安全: 使用新鲜鸡蛋并防止细菌污染，如接触污染蛋清，立即用肥皂和水彻底清洗
- 设施确认: 实验开始前确认洗眼器、紧急喷淋装置的位置和可用性
- 泄漏处理: 使用沙子、硅藻土等吸附材料覆盖吸收
6. 特别注意事项
- 盐酸的极端危险性: 本实验中使用盐酸调节pH值是最高风险步骤，必须严格在通风橱中操作
- 实验废弃物: 含酸废液应单独收集、正确标识，按照实验室规定处理