生物化学实验手册

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实验八 DNA的提取和分析（三） ​

PCR扩增目的DNA ​

目的和要求 ​

  1. 学习PCR反应扩增DNA片段的原理和引物设计原则。
  2. 了解扩增过程中各因素对扩增结果的影响。
  3. 掌握PCR反应扩增DNA的操作方法。

实验原理 ​

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）是在模板、四种dNTPs及两种特异性引物存在下，由耐热性Taq酶催化核苷酸的聚合，从而使极微量的目的DNA片段得以大量扩增，是分子生物学研究中常用且必备的一种技术手段。

在PCR反应中，由双链DNA高温变性，低温退火与适温延长三个步骤构成一个循环。理论上，经n次PCR循环后，目的DNA片段的分子数可以达到 ，而每一次循环则仅需要几分钟。具体原理如下图所示。

①高温变性（denaturation）：高温（通常 ）变性双链模板DNA； ②退火（annealing）：当温度降低时，由于模板DNA结构比引物复杂，且引物大大过量，使引物与模板局部互补形成杂交双链，而模板DNA双链之间互补的机会较少； ③ 延伸（extension）：适温（ ）下Taq酶沿5'-3'方向催化以引物为起点的DNA链延伸反应。

以上三个步骤形成一个循环，每一个循环的产物可以作为下一循环的模板。经过25-30个循环，介于两引物之间的特异DNA片段得到大量扩增，数量可达到 拷贝。

在实际操作中，一个完整的PCR过程包括预变性、主体循环、补平和低温保存四个部分组成。预变性的目的是使模板充分变性，露出引物的互补序列。补平的目的是使末端不齐的产物补平。循环结束后来不及取出PCR产物时，在低温保存以防止产物降解，但长时间低温对PCR仪有害。

PCR 反应体系包括反应缓冲液、模板、引物、Taq 酶和 dNTPs。

实验试剂和器材 ​

（一）试剂 ​

1.大肠杆菌基因组DNA（实验六制备） 2.基因特异引物1和引物2

采用799f和1492r扩增细菌16S rDNA。

正向引物799f(5'-AACAGGATTAGATACCCTG-3')

反向引物1492r(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')

  1. PCR扩增试剂盒

（二）器材 ​

PCR扩增仪，PCR用离心管、微量移液枪。

实验方法 ​

1. 扩增体系（总体积为 ） ​

在一灭菌的小离心管中依次加入：

ddH2O 37.5 μl

10xPCR buffer 5 μl

dNTPs(10mM)

Primer1 (10 pmol/μl) 2 μl

Primer2 (10 pmol/μl) 2 μl

模板

Taq酶

把加好反应体系的离心管稍离心后，置冰上备用。

2. PCR循环 ​

Program1

Program2 (94°C/ 30 sec, 52°C/ 30 sec, 72°C/ 45 sec)× 30

Program3

Program4

反应完毕，取 PCR样品，用 琼脂糖电泳检查。紫外灯下照相。

注意事项 ​

  1. 小心加入扩增体系中各成分，避免污染，量取一定要准确。

  2. 轻弹离心管壁混匀扩增体系, 避免气泡。若有气泡产生, 可稍作离心。

  3. 所有 PCR 用离心管和枪头等均为一次性使用。

思考题 ​

通过查阅文献，简述PCR及其衍生技术在分子生物学研究中的应用。

危险与防护 ​

实验室安全风险评估与防护指南 ​

免责声明: 本指南由AI生成，仅供参考。所有实验操作必须在合格人员的监督下，并严格遵守您所在机构的具体安全规章制度（SOP）。在开始实验前，请务必查阅并理解所有化学品的安全技术说明书（SDS）。

1. 化学品危害分析

  • PCR试剂盒组分:
    • 风险评估: 由于无法查询到具体成分的安全数据，PCR试剂盒通常包含以下潜在风险成分：
      • DNA聚合酶: 通常为Taq聚合酶，可能含有缓冲液和稳定剂
      • dNTPs混合物: 脱氧核苷三磷酸
      • 引物: 特定DNA序列的寡核苷酸
    • 主要暴露途径: 皮肤接触、吸入（极小量）、眼睛接触
    • 潜在风险: 生物源物质可能的过敏反应，试剂成分的化学毒性

2. 关键操作风险预警 (按实验步骤)

  • 步骤: 配制PCR反应体系

    • 风险剖析: 使用微量移液枪转移试剂过程中，若操作不当可能产生气溶胶或发生液体溅出，导致潜在的化学或生物暴露风险
    • 核心风险: 气溶胶产生与接触暴露

  • 步骤: 高温变性(94°C)

    • 风险剖析: PCR管在高温下可能因压力变化而发生破裂或爆管，导致热玻璃/塑料碎片飞溅和试剂泄漏
    • 核心风险: 热伤害与化学品泄漏

  • 步骤: 琼脂糖凝胶电泳分析

    • 风险剖析: 使用溴化乙锭(EB)或其他核酸染料进行染色时，这些物质多为强诱变剂
    • 核心风险: 基因毒性物质的潜在暴露

  • 步骤: 紫外灯下观察和照相

    • 风险剖析: 直接暴露于紫外灯下可能对皮肤和眼睛造成损伤，包括光敏反应和眼部灼伤
    • 核心风险: 紫外线辐射伤害

3. 综合安全防护措施

  • 个人防护装备 (PPE):

    • 通用要求: 必须穿着实验服或白大褂
    • 手部防护: 一次性丁腈手套
    • 眼部防护: 防飞溅护目镜（特别是在离心和加热步骤）
    • 特殊防护: 在紫外观察时，建议佩戴紫外线防护面罩或眼镜

  • 工程控制措施:

    • 样品配制应在洁净的工作台面上进行
    • 离心操作时应确保离心机盖牢固关闭
    • 紫外观察室应配备适当的紫外线屏蔽设施

  • 安全操作规程:

    • 移液操作: 使用正确的移液技术，避免产生气溶胶
    • PCR管使用: 确保使用经认证的PCR专用管，避免高温下爆管
    • 废液处理: PCR相关废液应按生物危险废物处理规范进行分类收集
    • 污染控制: 严格遵守一次性使用原则，防止DNA污染

  • 环境控制:

    • 保持实验室良好通风
    • 设置专用区域进行PCR样品制备和产物分析，防止交叉污染

4. 应急处理预案

  • 化学品接触: 立即用大量流水冲洗至少15分钟，如出现不适立即就医
  • 碎片伤害: 如发生爆管，首先断电，佩戴厚手套清理碎片，用适当消毒剂处理污染区域
  • 紫外线暴露: 立即离开紫外线照射区域，如出现皮肤红肿或眼部不适，立即就医
  • 小型泄漏: 佩戴适当PPE，使用吸收材料处理，按实验室规定程序处置污染物

5. 特别注意事项

  1. 生物安全: PCR产物可能含有扩增的DNA片段，应视为潜在的生物危害物
  2. 热电风险: PCR仪在运行过程中表面温度较高，避免直接接触
  3. 时间控制: 严格遵守程序时间设置，防止因超时运行导致的设备故障
  4. 记录要求: 完整记录所有实验步骤和观察结果，便于追溯和分析

重要提醒: 由于未能查询到PCR试剂盒中具体化学品的权威安全数据，建议实验人员在操作前务必查阅每个试剂的具体安全技术说明书(SDS)，并根据实验室的具体条件调整防护措施。