生物化学实验手册

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实验十一 血清谷丙转氨酶(SGPT)的测定 ​

目的和要求 ​

  1. 了解谷丙转氨酶活性测定的基本原理。 2.掌握谷丙转氨酶活性测定的方法

实验原理 ​

血清谷丙转氨酶(SGPT)能催化丙氨酸和α-酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸。丙酮酸在酸性条件下与2,4一二硝基苯肼可缩合生成丙酮酸二硝基苯脲,其在碱性条件下呈现棕红色,在520nm处有最大吸收。根据颜色的深浅,通过比色法可计算出酶活性,GPT在肝脏中含量最多,当某种药物对肝脏造成损害或病毒肝炎的急性阶段,由于肝细胞受损,GPT就释放到血液中,使血清中此酶水平明显升高。因此测定血清谷丙转氨酶的活性可作为诊断肝病的重要指标。

实验试剂和器材 ​

（一）试剂 ​

1.0.1M磷酸盐缓冲液（pH7.4） 2.丙酮酸标准液（

准确称取 纯净丙酮酸钠，用 磷酸盐缓冲液定容至

3. 谷丙转氨酶底物溶液 ​

准确称取 一酮戊二酸 -丙氨酸 ,溶于 pH7.4 磷酸盐缓冲液中,用 20% NaOH 调 为 7.4,然后加以上磷酸盐缓冲液至 , 加几滴氯仿防腐,冰箱保存可放一周。

4.2，4一二硝基苯肼溶液（1mM） ​

称取2，4一二硝基苯肼 ，置于 容量瓶中，先用 浓盐酸溶解后，再加水稀释到刻度。

5.0.4M氢氧化钠。 ​

（二）器材 ​

试管及试管架, 0.1、0.5、1 及 移液枪或吸量管, 恒温水浴, 分光光度计。

实验方法 ​

（一）标准曲线绘制 ​

取6支干燥洁净的试管，按下表操作：

各管摇匀， 水浴箱预热10分钟

管号 试剂012345
0.1M 磷酸盐缓冲液 (mL)0.100.100.100.100.100.10
SGPT 底物溶液 (mL)0.500.450.400.350.300.25
2μmol/mL 丙酮酸标准液 (mL)0.000.050.100.150.200.25

各管摇匀， 水浴箱预热20分钟

| 2,4-二硝基苯肼溶液 | 0.5mL | 0.5mL | 0.5mL | 0.5mL | 0.5mL | 0.5mL |

充分摇匀，在30分钟内， 处比色

| 0.4M NaOH (mL) | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 |

| 相当于丙酮酸含量(μmol) | 0 | 0.1 | 0.2 | 0.3 | 0.4 | 0.5 | | 相当于酶活力单位/100mL血清 | 0 | 100 | 200 | 300 | 400 | 500 | | A520 | | | | | | | | 各测定管减空白管A520值差 | | | | | | |

以吸光度值为纵坐标，酶活力单位数为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。

（二）血清SGPT活力测定 ​

取4支干燥洁净试管，按下表操作：

各管摇匀， 水浴60分钟

试剂\管号对照管测定管
1212
血清0.10.10.10.1
SGPT底物溶液(mL)--0.50.5

各管摇匀， 水浴20分钟

| 2,4-二硝基苯肼溶液(mL) | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | | SGPT底物溶液(mL) | 0.5 | 0.5 | - | - |

充分摇匀, 静置 10 分钟后, 处比色 (以 校正光吸收为零)

| 0.4M NaOH (mL) | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 |

| A520 | | | | | | 各测定管减对照管 A520 值差 | | | | |

注意事项 ​

  1. 在测定 SGPT 时，应事先将底物、血清在 水浴中保温，然后在血清管中加入底物，准确记时。
  2. 标准曲线上数值在 是准确可靠的，超过 时，需将样品稀释。
  3. 转氨酶只能作用于 -L-氨基酸, 对 D-氨基酸无作用。实验室多用 -DL-氨基酸 (较 L-氨基酸价廉), 若用 L-氨基酸, 则用量减半。
  4. 溶血标本不宜使用，因血细胞中转氨酶活力较高，会影响测定效果。
  5. 血清样品的测定需在显色后30分钟内完成。

思考题 ​

  1. 什么叫转氨基作用？在蛋白质代谢中有何重要作用？
  2. 为什么制作标准曲线时，需要加入一定量 SGPT 底物溶液？在实验设计上有无可改进之处？
  3. 为什么测定酶活力时需要有对照？

我将严格遵循工作流程，首先进行信息提取和风险评估，最后生成安全防护指南。

危险与防护 ​

实验室安全风险评估与防护指南 ​

免责声明: 本指南由AI生成，仅供参考。所有实验操作必须在合格人员的监督下，并严格遵守您所在机构的具体安全规章制度（SOP）。在开始实验前，请务必查阅并理解所有化学品的安全技术说明书（SDS）。

1. 化学品危害分析

  • 盐酸 (浓盐酸):
    • GHS危险性: 腐蚀性(GHS05)、急性毒性(GHS06)、压缩气体(GHS04)
    • 主要暴露途径: 吸入蒸气、皮肤接触、眼睛接触
    • 靶器官: 呼吸道、皮肤、眼睛
    • 急性接触症状: 皮肤灼伤、眼睛损伤、呼吸道刺激
    • 物理危害: 强腐蚀性，遇金属产生易燃氢气
  • 2,4-二硝基苯肼:
    • GHS危险性: 易燃性(GHS02)、皮肤刺激(GHS07)
    • 主要暴露途径: 粉尘吸入、皮肤接触
    • 急性接触症状: 皮肤刺激、呼吸道刺激
  • 氯仿:
    • GHS危险性: 急性毒性(GHS06)、致癌性(GHS08)
    • 靶器官: 肝脏、肾脏、中枢神经系统
    • 急性接触症状: 头晕、恶心；长期暴露可能致癌

2. 关键操作风险预警 (按实验步骤)

  • 步骤: 配制2,4-二硝基苯肼溶液（浓盐酸溶解）
    • 风险剖析: 浓盐酸具有强腐蚀性和挥发性，溶解过程会释放氯化氢气体，可能造成呼吸道刺激和眼睛灼伤
    • 核心风险: 化学灼伤与吸入暴露
  • 步骤: 移液操作（浓盐酸/NaOH转移）
    • 风险剖析: 移液过程中可能发生液体飞溅，0.4M NaOH虽浓度较低但仍具刺激性
    • 核心风险: 皮肤/眼睛化学灼伤
  • 步骤: 水浴温育（含氯防腐剂的底物溶液）
    • 风险剖析: 37°C加热加速氯仿挥发，可能产生致癌蒸气
    • 核心风险: 致癌物吸入暴露
  • 步骤: 显色反应（酸性条件）
    • 风险剖析: 酸性环境下2,4-二硝基苯肼可能分解产生有毒氮氧化物
    • 核心风险: 有毒气体释放

3. 综合安全防护措施

  • 个人防护装备 (PPE):
    • 手部防护: 双层丁腈手套（内层）+ 防酸手套（外层处理浓盐酸时）
    • 眼部防护: 全封闭式化学防护眼镜 + 面部防护罩
    • 身体防护: 防酸碱实验服 + 前胸防溅围裙
    • 呼吸防护: 通风橱内操作（无需额外呼吸器）
  • 工程控制:
    • 所有涉及浓盐酸的操作必须在通风橱内进行
    • 水浴锅应配备局部排气装置
    • 显色反应步骤需在通风橱中完成
  • 安全操作规程:
    • 浓盐酸稀释：遵循"酸入水"原则，禁止反向操作
    • 氯仿防腐底物：密封保存，开瓶前预冷减少挥发
    • 移液操作：使用带滤芯的移液枪头防止气溶胶
  • 应急处理:
    • 酸液接触：立即用大量流水冲洗 ≥15分钟
    • 氯仿吸入：转移至空气新鲜处，必要时供氧
    • 火灾：碳酸氢钠干粉灭火器（禁用含水灭火剂）
  • 废物处理:
    • 含氯仿废液：专用卤代有机溶剂废液桶
    • 苯肼废液：单独收集并标记"有毒有机物"

基于最小可行性原则：重点防护浓盐酸操作（强制通风橱），氯仿因用量极少（数滴）可简化防护，但需确保操作环境通风良好。血清样品按生物危害废物处理。