实验一 蛋白质的性质实验（一）
呈色反应和沉淀反应
目的和要求
- 学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法及其原理。
- 加深对蛋白质胶体分子稳定因素的认识，了解蛋白质的沉淀反应、变性作用的原理及其相互关系。
实验原理
（一）蛋白质及氨基酸的呈色反应
蛋白质所含有的某些氨基酸具有特殊结构，可以与某些试剂反应，生成有色物质。
1. 双缩脲反应
尿素被加热至 左右时，两分子尿素缩合放出一分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性条件下可与 结合生成复杂的紫红色化合物。此反应称为双缩脲反应。
所有含有两个或两个以上肽键的化合物均有此反应。
蛋白质或二肽以上的多肽分子中，含有多个与双缩脲结构相似的肽键，因此也有双缩脲反应，可用此法鉴定蛋白质的存在或测定其含量。
2. 苗三酮反应
蛋白质、多肽和各种氨基酸具有茚三酮反应。除无 -氨基的脯氨酸和羟脯氨酸呈黄色外，其他氨基酸生成紫红色，最终为蓝色化合物。
除蛋白质、多肽和各种氨基酸能进行茚三酮反应外,氨、 -丙氨酸和许多一级胺化合物
都有此反应。该反应灵敏度达1:1500000（pH5-7）。现已广泛地用于氨基酸定量测定。
（二）蛋白质的沉淀反应
蛋白质分子由于形成水化层和双电层而成为稳定的胶体颗粒。但是，蛋白质胶体颗粒的稳定性是有条件的、相对的，在一定的物理化学因素影响下，蛋白质颗粒失去电荷、脱水，甚至变性而丧失稳定因素，即以固态形式从溶液中析出，这种作用称为蛋白质的沉淀反应。该反应可分为以下两种类型：
1. 可逆沉淀反应
在发生沉淀反应时，蛋白质虽已沉淀析出，但其分子内部结构并未发生显著变化，基本上保持原有的性质。沉淀因素除去后，蛋白质沉淀可再溶于原来的溶剂中。这种沉淀反应称为可逆沉淀反应。属于此类反应的有盐析作用：在低温下，乙醇或丙酮对蛋白质的短时间作用以及等电点沉淀等。
用大量中性盐使蛋白质从溶液中析出的过程称为蛋白质的盐析作用。蛋白质是亲水胶体，在高浓度的中性盐影响下，蛋白质分子被盐脱去水化层，同时，蛋白质分子所带的电荷被中和，蛋白质的胶体稳定性遭到破坏而沉淀析出。沉淀出的蛋白质仍保持其天然蛋白质的性质，若减低盐的浓度时，还能溶解。
沉淀不同的蛋白质所需中性盐的浓度、种类不同，所以在不同条件下，采用不同浓度的盐类可将各种蛋白质从混合溶液中分别沉淀析出，这种方法称为蛋白质的分级盐析。它在酶的生产和制备等工作中被广泛应用。
2. 不可逆的沉淀反应
在发生沉淀反应时，蛋白质的分子内部结构，空间构象遭到破坏，失去其天然蛋白质的性质，这时蛋白质已发生变性。变性后的蛋白质沉淀不能再溶解于原来的溶液中，这种沉淀反应称为不可逆沉淀反应。重金属盐、生物碱试剂、过酸、过碱、加热、震荡、超生波、有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆沉淀反应。
重金属盐类易与蛋白质结合成稳定的沉淀而析出。蛋白质在水溶液中是酸碱两性电解质，在碱性溶液中（对蛋白质等电点而言），蛋白质分子带负电荷，能与带正电荷的金属离子，如 、 、 、 、 结合成蛋白质盐。在有机体内，蛋白质常以其可溶性的钠盐或钾盐存在，当加入汞、铅、铜、银等重金属盐时，则蛋白质形成不溶性的盐类而沉淀。经过这种处理后的蛋白质沉淀不再溶解在水中，说明它已发生了变性。重金属盐类沉淀蛋白质的反应通常很完全，因此，生化分析中，常用重金属盐除去体液中的蛋白质；临床上则用蛋白质解除重金属盐食物性中毒。但应注意，过量的醋酸铅或硫酸铜可使沉淀的蛋白质再溶
解.
蛋白质在有机酸的作用下带正电荷，与酸根的负电荷结合成为溶解度很小的盐类而沉淀。三氯乙酸和磺基水杨酸最有效，可将血清等生物体液中的蛋白质完全除去，因此得到广泛应用。
实验试剂和器材
（一）试剂
1.卵清蛋白溶液：取5mL鸡蛋清，用蒸馏水稀释至100mL，搅拌均匀后用4~8层纱布过滤，新鲜配制。 2. 蛋白质-NaCl溶液：取 蛋清，加蒸馏水 和饱和氯化钠溶液 ，充分搅匀后，以纱布滤去不溶物（加入氯化钠的目的是溶解球蛋白）。 3.05% 甘氨酸 4. 双缩脲试剂：称取 和 酒石酸钾钠，溶于 水中。在搅拌下加入 溶液，定容至 1 升。 5.0.1% 苯三酮乙醇溶液；将 苯三酮溶于 乙醇中。（现配） 6.2%硝酸银 7.10% 三氯乙酸 8.饱和硫酸铵溶液，硫酸铵粉末 9.尿素
（二）器材
试管及试管架，酒精灯，玻璃漏斗，滤纸，移液管，滴管，恒温水浴。
实验方法
1. 双缩脲反应
取少量尿素结晶，加入干燥试管中，用微火加热使尿素熔化。熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。冷后加入10滴双缩脲试剂，混匀，观察颜色变化。
另取1支试管，加入卵清蛋白溶液 再加入5滴双缩脲试剂，混匀，观察颜色变化。
2.茚三酮反应
取2支试管，分别加入卵清蛋白溶液和 甘氨酸溶液4滴，再加入2滴 芎三酮乙醇溶液，混匀，在沸水浴中加热 分钟，观察颜色变化，并比较蛋白质和氨基酸呈色深浅。
3. 蛋白质的盐析作用
取1支试管，加入 蛋白质- 溶液和 饱和硫酸铵溶液，混匀，静置10分钟，球蛋白则沉淀析出。过滤后向滤液中加入硫酸铵粉末，边加边用玻璃棒搅拌，至粉末不再溶解，析出的沉淀为清蛋白。静置，弃上部清液，取部分清蛋白沉淀加水稀释，观察它是否溶解。
4. 重金属沉淀蛋白质
取1支试管，加入 卵清蛋白质液，再加入 硝酸银溶液1滴，观察沉淀的生成。
5.有机酸沉淀蛋白质
取 1 支试管, 加入卵清蛋白质液约 , 然后滴加 三氯乙酸溶液数滴, 观察沉淀的生成。
思考题
如果蛋白质水解作用一直进行到双缩脲反应呈阴性结果, 此作何结论?
苷三酮反应的阳性结果是否经常是同一色调？若不是，为什么？
蛋白质分子中的哪些基团可以与
(1)重金属离子作用而使蛋白质沉淀？ (2)有机酸、无机酸作用而使蛋白质沉淀？
危险与防护
实验室安全风险评估与防护指南
免责声明: 本指南由AI生成，仅供参考。所有实验操作必须在合格人员的监督下，并严格遵守您所在机构的具体安全规章制度（SOP）。在开始实验前，请务必查阅并理解所有化学品的安全技术说明书（SDS）。
1. 化学品危害分析
尿素:
- GHS危险性: 暂无具体的危险性分类数据。
- 主要暴露途径: 吸入气溶胶、食入。
- 急性接触症状: 咳嗽、气短、喉咙痛（吸入）；发红（皮肤/眼睛）；痉挛、头痛、恶心、呕吐（食入）。
- 物理危害: 相对安全，无明显物理危害。
硫酸铜:
- GHS危险性: 刺激性（GHS07）、环境危害（GHS09）。
- 主要暴露途径: 吸入气溶胶、食入。
- 靶器官: 中枢神经系统、肝脏、肾脏。
- 急性接触症状: 咳嗽、喉咙痛（吸入）；发红、疼痛（皮肤）；发红、疼痛、视力模糊（眼睛）；腹痛、灼烧感、恶心、呕吐、休克（食入）。
- 物理危害: 中等刺激性。
硝酸银:
- GHS危险性: 氧化剂（GHS03）、腐蚀性（GHS05）、环境危害（GHS09）。
2. 未查询到具体数据的化学品通用警告 以下化学品需要特别注意，未能通过工具查询到完整的GHS危害分类，但基于其化学性质存在潜在风险：
- 三氯乙酸: 腐蚀性有机酸，可能对皮肤、眼睛和呼吸道造成严重损伤。
- 硫酸铵: 中低风险，但仍需避免吸入粉尘和皮肤接触。
- 茚三酮: 可燃有机化合物，避免吸入和皮肤接触。
3. 关键操作风险预警 (按实验步骤)
步骤: 加热尿素制备双缩脲
- 风险剖析: 加热尿素至约180°C时，可能释放氨气，氨气具有刺激性，可能引起呼吸道不适。
步骤: 双缩脲反应（加入硫酸铜）
- 风险剖析: 硫酸铜具有一定毒性，在倾倒和混合过程中可能产生粉尘或溅出。
- 核心风险: 吸入毒性和氨气暴露
步骤: 重金属沉淀（加入硝酸银）
- 风险剖析: 硝酸银是强氧化剂和腐蚀性化学品。在打开瓶盖、转移和滴加过程中，硝酸银可能腐蚀皮肤、眼睛和组织。任何滴溅都可能导致严重的化学灼伤。
- 核心风险: 化学灼伤 与 氧化反应
步骤: 有机酸沉淀（加入三氯乙酸）
- 风险剖析: 三氯乙酸具有强腐蚀性。在转移过程中，挥发的气体可能被吸入，对呼吸道造成损伤。
步骤: 盐析作用（处理硫酸铵溶液）
- 风险剖析: 硫酸铵粉尘可能刺激呼吸道和眼睛。
4. 综合安全防护措施
个人防护装备 (PPE):
- 通用要求: 必须穿着实验服。
- 手套: 建议佩戴耐化学品手套（丁腈或乳胶手套）。
- 眼部防护: 必须佩戴化学安全护目镜。
- 实验现场操作: 所有涉及潜在溅出或气溶胶产生的步骤，强烈建议佩戴防护面罩。
- 呼吸防护: 对于有挥发性或粉尘产生的操作，建议佩戴N95口罩。
- 身体防护: 建议穿着防化围裙。
工程控制:
- 通风条件: 所有涉及挥发性、腐蚀性或毒性化学品的操作必须在化学通风橱中进行。
安全操作规程:
- 倾注液体时应缓慢进行。
- 加热操作时，应使用适当的加热设备，远离火源。
- 容器管理: 保持容器密闭，仅在通风良好处打开。
5. 应急处理预案
- 化学品接触:
- 皮肤/眼睛接触: 立即用大量流水冲洗至少15分钟，并寻求医疗救助。
- 小型泄漏: 使用合适的吸收材料（如沙子、蛭石）吸收，然后收集到适当的容器中。
- 火灾: 如遇火灾，切断电源，使用合适的灭火器（CO2、干粉），从安全距离使用水喷雾冷却容器。
总结： 本蛋白质性质实验总体上属于低至中等风险水平，主要风险集中在硝酸银（强氧化剂和腐蚀性）和三氯乙酸（强腐蚀性）的使用。实验人员必须严格遵守以上安全防护措施，确保操作安全。