实验四 蛋白质的提取和分析（二）
蛋白质浓度的测定
目的和要求
- 了解考马斯亮蓝 G250 法测定蛋白质含量的基本原理。
- 掌握标准曲线法测定蛋白质含量的基本操作。
- 掌握 UV2100 型分光光度计的使用方法。
实验原理
考马斯亮蓝 G250 在酸性溶液中呈茶棕色，最大吸收峰在 。考马斯亮蓝可与蛋白质以范德华力结合。当与蛋白质结合后变成深蓝色，最大吸收峰转至 ，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，测定范围 蛋白质。
实验试剂和器材
（一）试剂
- 标准蛋白溶液：用生理盐水配制 的蛋白溶液。 2.考马斯亮蓝G250试剂
称 考马斯亮蓝 G250, 溶于 乙醇后, 加蒸馏水约 , 加 磷酸 , 最后补足水到 , 混匀过滤, 保存在棕色瓶中, 可使用数周, 但使用前需重新过滤。
（二）器材
试管及试管架，移液枪， 移液管，分光光度计。
实验方法
（一）蛋白样品的制备
溶菌酶样品：制备及纯化方法见实验三。
（二）标准曲线的制作与样品测定
| 管号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 100 μg/mL 标准蛋白溶 液(mL) | 0 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 | / |
| 未知蛋白样品 | / | / | / | / | / | / | 0.2 |
| dH2O(mL) | 1.0 | 0.8 | 0.6 | 0.4 | 0.2 | 0.0 | 0.8 |
| G250 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 |
混匀,室温下放置5~30分钟,595nm读OD值
注意事项
- 蛋白质样品和显色剂都不应有沉淀，有沉淀应过滤除去。
- 染料与蛋白质形成的蓝色化合物易轻度沾附试管壁或比色皿，使用完应立即冲洗干净。
- 待测样品的浓度超出测定范围时，应对样品做适当处理，使其浓度在标准曲线测试范围内。
思考题
- 说明如何选择适宜的方法以保证蛋白质浓度测定的准确性？
危险与防护
实验室安全风险评估与防护指南
免责声明: 本指南由AI生成，仅供参考。所有实验操作必须在合格人员的监督下，并严格遵守您所在机构的具体安全规章制度（SOP）。在开始实验前，请务必查阅并理解所有化学品的安全技术说明书（SDS）。
1. 化学品危害分析
化学品1: 考马斯亮蓝 G250 (Coomassie Brilliant Blue G250):
- GHS危险性: GHS09 (环境危害)
- 主要暴露途径: 吸入、皮肤接触
- 主要风险: 对水生环境有害
化学品2: 乙醇 (Ethanol):
- GHS危险性: GHS02 (易燃液体和蒸气)
- 主要暴露途径: 吸入、皮肤接触
- 急性接触症状: 对皮肤有轻度刺激，对中枢神经系统有影响
- 物理危害: 高度易燃，闪点极低，火焰可能呈不可见状态
化学品3: 磷酸 (Phosphoric acid):
- GHS危险性: GHS05 (腐蚀性)
- 主要暴露途径: 吸入、皮肤接触、眼睛接触
- 其他风险: 呼吸道毒性
2. 实验操作风险识别
- 考马斯亮蓝染料制备过程（涉及95%乙醇和85%磷酸）：
- 识别化学品: 乙醇、磷酸
- 操作: 称重、溶解、过滤
- 标准曲线制作（涉及移液操作）：
- 识别化学品: 标准蛋白溶液、考马斯亮蓝试剂
- 操作: 移液枪操作、混合、分光光度计使用
3. 关键操作风险预警 (按实验步骤)
步骤: 配制考马斯亮蓝 G250 试剂
- 风险剖析: 该步骤涉及将100mg染料溶于95%乙醇，再加入85%磷酸。乙醇是高度易燃液体，加热或遇到火源极易着火；磷酸具有强腐蚀性，对皮肤和呼吸道有强烈刺激
- 核心风险: 火灾 与 化学灼伤
步骤: 标准曲线制作中的移液操作
- 风险剖析: 使用移液枪转移含乙醇和磷酸的溶液，存在滴溅风险，可能导致腐蚀性化学品接触皮肤或眼睛
步骤: 混合反应和分光光度计测量
- 风险剖析: 染料与蛋白质形成的蓝色化合物有轻度沾附性，污染设备
- 核心风险: 设备污染 与 实验误差
4. 综合安全防护措施
个人防护装备 (PPE):
- 通用要求: 始终穿着实验服
- 手套: 推荐使用丁腈手套
- 眼部防护: 化学安全护目镜
- 其他: 实验室区域应佩戴合适的防护装备
工程控制:
- 配制试剂步骤: 必须在"化学通风橱"中进行，特别是处理挥发性乙醇和腐蚀性磷酸时
- 光度计操作: 确保操作区域通风良好
5. 应急处理预案
- 化学品接触: 立即用大量流水冲洗至少15分钟，并寻求医疗救助
- 小型泄漏: 使用合适的吸收材料处理，避免与环境水源接触
- 火灾: 对于乙醇火灾，使用干粉、二氧化碳或抗醇泡沫灭火器
6. 特别注意事项
- 考马斯亮蓝G250对环境有害，废液必须按规定处理
- 蛋白质和显色剂溶液必须无沉淀，如有沉淀应过滤除去
- 染料易沾附设备表面，使用后应立即彻底清洗
风险评估总结: 本实验主要风险集中在试剂配制阶段，涉及易燃乙醇和腐蚀性磷酸的混合操作。必须严格在通风橱内进行，并佩戴全套PPE。实验过程中需严格执行操作规范，确保实验室安全。