实验七 DNA的提取和分析（二）
DNA的紫外测定
目的和要求
- 掌握紫外吸收法检测DNA浓度和纯度的原理和方法。
- 熟悉紫外分光光度计的使用方法。
实验原理
由于核酸中的碱基都具有共轭双键，所以具有紫外光吸收性质。在紫外光谱区，核酸有一条典型的吸收曲线，其吸收高峰在 处，吸收低谷在 处。由于蛋白质在紫外区的吸收高峰在 处，所以可以利用核酸的紫外吸收光谱数据来鉴定核酸的纯度和浓度。此法的缺点是不能区分 DNA 和 RNA。
当波长为 时，DNA或RNA的光密度OD260不仅与其总含量有关，也随着构型而有所差异。当 时，双链DNA浓度约为 ，单链DNA浓度约为 ，RNA浓度约为 ，寡核苷酸浓度约为 。
在纯度鉴定时，需同时测定在260和 处的消光值。经验数据表明，纯净的核酸溶液其A260/A280大于或等于1.80。A260/A280值过小，说明蛋白未脱净；A260/A280值过大，则表明有RNA污染。也可用A260/A230的比值鉴定核酸的纯度。纯净的核酸溶液A260/A230的比大于或等于2.0，A260/A230过小，说明有杂质（一般为多酚类或色素）。
在测定核酸粗制品时，样品中残留的蛋白质、色素等具有紫外吸收特性的杂质对测定有明显干扰作用。大分子核酸制备过程中也会变性降解有增色效应，则OD读数和比值均会发生变化，此时无法用分光光度法对核酸进行准确定量，可使用其它方法进行估算。
实验试剂和器材
（一）试剂
DNA样品、灭菌重蒸水、TE缓冲液。
（二）器材
Ep管、移液枪、石英比色皿、紫外分光光度计等。
实验方法
将紫外分光光度计开机预热 10 分钟。
用重蒸水洗涤比色皿，吸水纸吸干。
在 波长下，以 TE 缓冲液为参比，校正光吸收值为零，分别测定待测样品的 OD 值。
分析待测样品的浓度与纯度。
DNA样品浓度（ 稀释倍数/测定体积
注意事项
紫外光谱区核酸的吸收曲线有一定的线性范围, 要注意 DNA 的稀释度。待测样品若浓度较高, 需用 TE 缓冲液适当稀释后方可测定。
思考题
根据数据，计算待测样品的浓度和纯度，并对你的实验结果做出评价。
危险与防护
实验室安全风险评估与防护指南
免责声明: 本指南由AI生成，仅供参考。所有实验操作必须在合格人员的监督下，并严格遵守您所在机构的具体安全规章制度（SOP）。在开始实验前，请务必查阅并理解所有化学品的安全技术说明书（SDS）。
1. 化学品危害分析
- TE缓冲液:
- 主要成分: Tris和EDTA
- Tris (CID: 6503):
- GHS危险性: 刺激性（Irritant）
- 主要暴露途径: 皮肤接触、眼睛接触
- 急性接触症状: 可能导致皮肤和眼睛刺激
- 物理危害: 无明显严重物理危害
- EDTA (CID: 6049):
- GHS危险性: 刺激性（Irritant）
- 主要暴露途径: 皮肤接触、眼睛接触
- 急性接触症状: 刺激皮肤和黏膜
- DNA样品:
- 未能查询到具体DNA安全数据，请自行查阅相关生物安全技术说明书。建议按生物安全二级实验室要求操作。
2. 关键操作风险预警 (按实验步骤)
步骤: 预热紫外分光光度计和操作仪器
- 风险剖析: 紫外分光光度计使用高压汞灯或氘灯，不当操作可能造成电击风险
- 核心风险: 电击危险
步骤: 使用石英比色皿进行测量
- 风险剖析: 石英比色皿易碎，破损时可能造成划伤，同时容器内的化学品可能泄漏造成二次污染
- 核心风险: 机械伤害与化学品泄漏
步骤: 使用移液枪进行样品稀释和转移
- 风险剖析: 不当使用移液枪可能导致样品飞溅或滴漏，造成环境污染和个人暴露风险
3. 综合安全防护措施
个人防护装备 (PPE):
- 手部防护: 丁腈手套（适合处理水溶液和一般化学品）
- 眼部/面部防护: 化学安全护目镜
- 身体防护: 实验服
- 呼吸防护: 在通风良好区域操作，一般无需特殊呼吸防护
工程控制:
- 实验应在通风良好的实验室内进行
- 操作时确保工作台面整洁，防止交叉污染
安全操作规程:
- 操作移液枪时保持稳定，避免产生气泡或滴漏
- 正确清洗和存放石英比色皿，防止破损
- 紫外分光光度计使用时避免直视光源
4. 应急处理预案
- 化学品接触: 立即用大量流水冲洗至少15分钟，并寻求医疗救助
- 小型泄漏: 使用吸水纸或专用吸收材料处理，避免皮肤直接接触
- 仪器故障: 立即切断电源，报告维修人员
实验室安全提示:
- 紫外分光光度计预热期间不要离开无人看管
- 样品稀释时注意浓度范围，避免超出仪器线性范围
- 所有废弃样品按生物废液处理要求进行分类和处理